Extraction d'ADN
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2008-04-03T16:22:24Z
Badmood
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L''''extraction de l'ADN''' est une technique permettant d'isoler l'[[Acide désoxyribonucléique|ADN]] de [[cellule (biologie)|cellule]]s ou de [[Tissu biologique|tissu]]s. L'ADN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour des recherches de [[biologie moléculaire]], telles que le [[Séquençage de l'ADN|séquençage]], la [[Réaction en chaîne par polymérase|PCR]] ou le [[clonage]]. Il existe différentes protocoles pour extraire l'ADN, qui suivent approximativement le même schéma de principe :
* [[Lyse]] des cellules
* Elimination des [[protéine]]s
* Elimination des autres acides nucléiques ([[Acide ribonucléique|ARN]]...)
* Concentration de l'ADN par [[précipitation]] à l'[[Éthanol|alcool]]
Différentes variantes sont employées, suivant que l'on cherche à extraire de l'ADN [[génomique]] (issu du ou des [[chromosome]]s des cellules analysées) ou de l'ADN plasmidique (provenant de [[plasmide]]s portés le plus souvent par des cellules [[bactérie]]nnes comme ''[[Escherichia coli]]''). Il existe aujourd'hui des [[kit d'extraction d'ADN|kits commerciaux]] permettant de réaliser rapidement ces extractions à l'aide de réactifs prêts à l'emploi.
== Préparation d'ADN génomique ==
On commence en général par une lyse des cellules ou des tissus, consistant éventuellement en un broyage, suivi d'une extraction par des [[détergent]]s, qui vont disperser les bicouches lipidiques des [[Membrane (biologie)|membranes]] et [[dénaturation|dénaturer]] les [[protéine]]s, et en particulier celles qui sont associées à l'ADN dans la [[chromatine]]. La solution obtenue est en général très visqueuse, car l'ADN ainsi libéré forme de très longs filaments qui s'opposent aux écoulements hydrodynamiques.
L'étape suivante est la déprotéinisation de la solution qui se fait par une extraction au moyen de solvants organiques, en général du [[phénol (molécule)|phénol]] additionné de plus ou moins de [[chloroforme]]. Les protéines dénaturées forment un précipité à l'interface phénol-eau, tandis que l'ADN reste en solution dans la phase aqueuse qui est récupérée par décantation ou par centrifugation.
L'ADN est ensuite précipité par addition d'[[éthanol]] ou d'[[isopropanol]] dans la phase aqueuse, collecté par centrifugation et dissous dans du tampon. Pour eliminer les traces de phénol et d'autres contaminants, on peut enfin pratiquer une [[dialyse]] ou une étape de purification par [[chromatographie]].
== Préparation d'ADN plasmidique ==
La préparation d'ADN plasmidique à partir de bactéries est l'une des techniques les plus courantes de la [[biologie moléculaire]], également connue sous le nom abrégé de [[Minipréparation|miniprep]]. Le principe de l'extraction est connu sous le nom de '''lyse alcaline'''<ref>A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. HC Birnboim & J Doly (1979) ''Nucleic acids res''. '''7''': 1513-1523 [http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=388356]</ref>. Cette methode permet de préparer sélectivement l'ADN du plasmide contenu dans les bactéries, tout en éliminant l'ADN du chromosome bactérien. Le principe de cette méthode consiste effectuer la lyse des cellules au moyen d'un [[détergent]] ([[laurylsulfate de sodium|dodécyl sulfate de sodium]]) en présence de [[Hydroxyde de sodium|soude]], à pH 13. A ce pH très alcalin, l'ADN est '''[[dénaturation|dénaturé]]''', c’est-à-dire que les deux brins de la double-hélice sont séparés. On neutralise ensuite rapidement la solution, ce qui provoque la renaturation brutale (réappariement des brins du duplex d'ADN). L'ADN chromosomique, très long (~10⁶ paires de base), ne parvient pas à se réapparier complètement et forme des enchevètrements insolubles. L'ADN plasmidique, court (~10³ paires de base), parvient a se reformer et reste en solution. On sépare alors les espèces par centrifugation. Les protéines précipitées, sont également éliminées avec le détergent et l'ADN chromosomique. L'ADN plasmidique est alors concentré par précipitation à l'alcool.
Différentes variantes ou améliorations de cette méthode existent notamment dans un grand nombre de [[kit d'extraction d'ADN|kits commerciaux]]. Ces derniers contiennent souvent des petites colonnes de [[Chromatographie en phase liquide|résine chromatographique échangeuse d'ion]], permettant d'améliorer la pureté de l'ADN obtenu. Pour éliminer les [[acide ribonucléique|ARN]], on ajoute fréquemment des [[ribonucléase]]s qui vont hydrolyser sélectivement ces acides nucléiques, en laissant l'ADN intact.
== Contrôle de l'extraction==
* Par électrophorèse sur [[gel d'agarose]], on peut analyser la présence et la taille des acides nucléiques contenus dans la préparation. Ceux-ci sont révélés par le [[bromure d'éthidium]], un colorant dont la fluorescence augment très sensiblement quand il interagit avec l'ADN. Dans le cas d'une préparation d'ADN plasmidique, on observe sous UV une ou plusieurs bandes colorées discretes dans le gel, correspondant à l'ADN du [[plasmide]]. Dans le cas d'ADN chromosomique, on observe un continuum de bandes, correspondant aux fragments d'ADN issus de la coupure statistique du chromosome résultant des traitements mécaniques lors de l'extraction.
* Par mesure de l'extinction dans l'UV au moyen d'un [[spectrophotomètre]]. L'ADN possède un maximum d'extinction à 254 nm. 1 unité d'absorbance à 254 nm correspond à environ 50 μg d'ADN double-brin.
exemple de kit :
* kit [[MoBio]] pour l'extraction d'ADN du sol.
== Notes et références ==
<references />
{{Portail|Biochimie|bbcm}}
[[catégorie:technique de biologie moléculaire]]
[[en:DNA extraction]]
[[id:Isolasi DNA]]
[[lt:DNR išskyrimas]]
[[zh:DNA提取]]