Microscope confocal 2903565 31468300 2008-07-10T14:22:34Z JAnDbot 127921 robot Retire: nl, zh Modifie: en, pl {{à sourcer|date=date inconnue}} {{Ébauche|optique}} Un '''microscope confocal''' est un [[microscope optique]] qui a la propriété de réaliser des images de très faible profondeur de champ (environ 400 nm) appelées « sections optiques ». En positionnant le plan focal de l’objectif à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon, il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet. L'objet n'est donc pas directement observé par l'utilisateur ; celui-ci voit une image recomposée par [[ordinateur]]. Le microscope confocal fonctionne en lumière réfléchie ou en [[microscope à fluorescence|fluorescence]]. La plupart du temps, on utilise un laser comme source de lumière. On parle alors de '''microscope confocal à balayage laser''' — '''MCBL''' (en anglais CLSM pour ''confocal laser scanning microscope''). Le principe du microscope confocal a été décrit par [[Marvin Minsky]] en [[1953]], mais ce n’est que dans la fin des [[années 1980]] que des modèles commerciaux sont apparus, rendant cette technique accessible à de nombreux laboratoires. La microscopie confocale est très utilisée aujourd'hui en biologie ainsi qu’en sciences des matériaux. == Principe et avantages == === Limite du microscope optique classique === En microscopie optique à champ large, pour qu'une image soit nette, il faut que l'objet soit dans le plan focal du système optique. Lorsqu'un objet est épais, présente un relief important, ou bien lorsqu'il est incliné par rapport à l'objectif, seule une partie de l'objet est nette dans l’image (voir l'article sur la [[profondeur de champ]]). De plus, plus le grossissement est élevé, plus cette profondeur est faible, ce qui empêche d'avoir une image nette sur la totalité d'un objet un peu étendu. Ceci est particulièrement ennuyeux pour les objets allongés comme les [[nerf]]s ; ils sont donc flous sur une partie de leur trajet quelle que soit l'habilité du préparateur. En fait, la microscopie à champ large pose un problème pour tous les objets ayant une certaine épaisseur. En effet, la lumière émise par le plan focal, donc nette, est perdue dans la fluorescence émise par les plans adjacents au plan focal, qui par définition sont flous. === Principe du microscope confocal === Pour résoudre ce problème, on éclaire la surface non plus par un faisceau de lumière blanche, mais par un rayon [[laser]], concentré par une lentille, qui balaie la surface en positionnant une sténopée (pinhole en anglais) devant le détecteur, dans un plan focal conjugué au plan focal de l’objectif (plans confocaux). De cette manière, seuls les photons provenant du plan focal passent la sténopée et participent à la formation de l’image, d'où le nom « confocal » (synonyme de monofocal). La lumière provenant des plans adjacents (floue) est arrêtée par les bords du trou. Il est ainsi possible d'obtenir une coupe optique nette correspondant uniquement au plan focal. En faisant varier ce plan on obtient une succession de coupes donnant des informations nettes et précises dans les trois dimensions de l'objet observé. L’emploi d’une source lumineuse cohérente (laser) ainsi que la taille réduite du champ éclairé permettent d’obtenir une résolution latérale légèrement meilleure (180-160 nm) à celle attendue pour un microscope optique conventionnel (200 nm). La résolution en ''Z'' (profondeur) est de l’ordre de 600 nm en microscopie confocale. La microscopie confocale permet des études sur du matériel fixé, mais permet également d'étudier des phénomènes dynamiques, sur des cellules ou des tissus vivants, en particulier grâce aux molécules de la famille GFP (Green Fluorescent Protein). Par ailleurs les évolutions permanentes de la technique permettent aujourd'hui de se pencher sur des processus d'interaction moléculaire (Technique du FRET), ou de dynamique moléculaire (FRAP, FLIP). == Description du dispositif == === Source de lumière === La plupart du temps, la source d'excitation utilisée n'est plus une lampe à arc, mais un (ou plusieurs) faisceau(x) laser. L'intérêt des laser est de fournir une lumière monochromatique plus spécifique et facile à contrôler (en terme de filtrage). De plus la finesse du pinceau laser permet d'améliorer considérablement la résolution en XY (dans le plan) du fait d'une moindre diffusion. Les lasers utilisés le plus fréquemment sont les suivants : * [[argon]]-[[ion]] ([[longueur d'onde|longueurs d'onde]] : 457nm, 488nm, 514nm) * [[hélium]]-[[néon]] (543nm) * hélium-néon (633nm) Si l'on utilise une source de lumière blanche à la place d'un laser, il est également possible d'obtenir des images en couleur avec un microscope confocal. Il est toutefois plus difficile de focaliser la lumière blanche avec une forte intensité sur l'objet, ce qui augmente le temps d'acquisition. Les microscopes confocaux en lumière blanche utilisent en général plusieurs rayons de manière simultanée, ce qui permet d'observer plusieurs endroit de l'échantillon à la fois. Grâce à des dispositfs astucieux comme un [[disque de Nipkov]], il est possible de réaliser des image en temps réel. === Système de balayage === Le balayage du champ observé par le laser se fait à l’aide de deux miroirs orthogonaux. Ils s'agit de miroirs galvanométriques très rapides (entre 200Hz et 2KHz selon les modèles) effectuant le balayage en X, suivi d'un miroir permettant le balayage en Y. Le positionnement de l’image dans la profondeur de l’échantillon est généralement obtenue en déplaçant en ''Z'' l’objectif à l’aide d’un quartz [[Piézoélectricité|piezoélectrique]] par pas successifs de 200-300nm. === Détecteurs === Les détecteurs utilisés sont des [[Photo-multiplicateur|tubes photo-multiplicateurs (PMT)]] ou par une caméra [[Charge-Coupled Device|CCD]] haute sensibilité. L’intensité lumineuse est mesurée et numérisée en fonction de la position du laser dans l’échantillon : on obtient directement des images numériques. L'utilisation de photomultiplicateurs (PMT) comme capteurs, à la place de l'œil ou de l'appareil photo, est rendu nécessaire par le très faible signal émis pour chaque position du faisceau. Pour chacune de ces positions, le PMT va produire un signal électrique proportionnel au niveau de lumière collecté. Ce signal électrique est ensuite digitalisé pour constituer alors une matrice de pixels. En travailant en 8 bits on obtient ainsi une image en 256 niveaux de gris, qui sont ensuite "colorés" artificiellement afin de différencier dans une superposition les fluorescence émises par plusieurs fluorochromes. Les images obtenues ont un champ variant de 64x64 à 2048x2048. Plus la résolution est élevée, plus le temps d'acquisition est long, ce qui peut devenir une limite pour l'acquisition de phénomènes biologique rapide sur du matériel vivant. Enfin, le fichier généré est plus volumineux (problème de stockage mémoire). === Traitement de l'image === Le résultat d'une observation en microscopie confocale peut être considéré comme une [[tomographie]] à l'échelle cellulaire. Une fois la tomographie obtenue, elle peut être traitée de différentes façons : * en réunissant les différentes images, on reconstitue une vue en 2D de l'ensemble de la préparation parfaitement nette en tout point ; * en créant une [[stéréoscopie|image stéréoscopique]] donnant une vue en trois dimensions de la préparation ; * comme tous les éléments d'une même image se trouvent à la même profondeur de la préparation, on peut déterminer les connexions entre les différents éléments observables. Ces usages ne sont toutefois pas limitatifs et dépendent des besoins et de l'imagination des scientifiques. == Autres techniques apparentées == === Microscope confocal à Disque Rotatif (ou disque de Nipkow) === {{...}} === Microscope confocal spectral (ou chromatique) === [[Image:systeme-chromatic.jpg|thumb|Système CHROMATIC]] La microcopie confocale chromatique repose sur le même principe que la microscopie confocale classique où on utilise une optique volontairement chromatique. L'appareil peut être vu schématiquement comme un empilement de microscopes confocaux classiques, un par longueur d’onde (autrement dit par couleur). Une analyse spectrale de la lumière repassant par diaphragme (ou filtre spatial) permet de connaitre la position de l’objet dans l’étendue de mesure du capteur. La microscopie confocale chromatique permet d’effectuer des meures avec une résolution axiale de quelques nanomètres et une résolution latérale inférieure au micron. Les étendues de mesures accessibles par cette technique vont de quelques dizaines de microns à quelques dizaines de millimètres. La microscopie confocale permet de mesurer la rugosité d’un échantillon, de faire une acquisition de profil, de topographie et si le matériau est transparent d’en mesurer l’épaisseur avec une précision de quelques microns. L’acceptance angulaire des microscopes confocaux est équivalente à celle des microscopes classiques et peut aller jusqu’à 45° sur des matériaux réfléchissants (comme un miroir) et 85° sur des matériaux diffusants (comme du plâtre). Le principe de mesure permet de ne pas avoir d’effet d’ombre. Les principaux domaines d’application principaux sont la mesure d’épaisseur de verre, la micro électronique pour la mesure d’épaisseur de wafer ou la mesure de hauteur de bumps. Généralement la microscopie confocale chromatique offre une flexibilité de mesure telle qu’elle peut être adaptée à tout type de mesure nécessitant une forte résolution pour une étendue de mesure de quelques dizaines de millimètres Contrairement à ce que beaucoup pense, la microscopie confocale ne doit pas être mise en opposition avec d’autres techniques de mesure comme l’interférométrie lumière blanche ou l’interférométrie faible cohérence mais doit être utilisée de façon complémentaire. Les principaux avantages de la microscopie confocale sont sa souplesse dans la configuration de la mesure, sa précision et sa rapidité. Elle sera très bien adaptée pour faire une mesure de profil de grande dimension (plusieurs centaines de millimètre) ou de topographie (quelques millimètres carrés à quelques dizaines de millimètres carrés). Elle cédera le pas à l’interférométrie lumière blanche pour des champs d’observations de quelques centaines de microns, lorsque l’acquisition de l’image doit être faite très rapidement. Dans ces configurations de mesure elle sera un peu moins bien adaptée bien qu’elle soit en mesure de fournir des résultats de très grande qualité. Pareillement, si l’application nécessite une étendue de mesure de grande dimension (supérieure à 40 millimètres) l’interférométrie faible cohérence devra être préférée à microscopie confocale. En effet, dans ce domaine d’étendue de mesure l’interférométrie faible cohérence permet d’aller jusqu’à 600mm (voire plusieurs mètres) avec une précision de 100nm à peine. == Voir aussi == *[[microscope optique]] == Références == {{Traduction/Référence|de|Konfokalmikroskop|34519837}} == Liens externes == * {{en}} [http://www.olympusconfocal.com/theory/confocalintro.html Une introduction à la microscopie confocale] * {{en}} [http://micro.magnet.fsu.edu/primer/virtual/confocal/index.html Un microscope confocal virtuel] {{Portail|physique}} [[Catégorie:Microscope optique|Confocal]] [[Catégorie:Biophysique]] [[Catégorie:Histologie]] [[Catégorie:Imagerie cellulaire]] [[cs:Konfokální mikroskop]] [[de:Konfokalmikroskop]] [[en:Confocal microscopy]] [[es:Microscopio confocal]] [[ko:공초점 레이저 주사 현미경]] [[pl:Mikroskopia konfokalna]] [[sv:Konfokalmikroskop]] [[ur:ہمرکز خردبینی]]