Plasmide
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2008-07-18T15:16:09Z
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==Types==
[[Image:BacterConjugation.png|right|350px|thumb|'''Figure 4:''' Overview of Bacterial conjugation]]
One way of grouping plasmids is by their ability to transfer to other bacteria. ''Conjugative'' plasmids contain so-called ''tra-genes'', which perform the complex process of ''[[Bacterial conjugation|conjugation]]'', the sexual transfer of plasmids to another bacterium (Fig. 4). ''Non-conjugative'' plasmids are incapable of initiating conjugation, hence they can only be transferred with the assistance of conjugative plasmids, by 'accident'. An intermediate class of plasmids are ''mobilizable'', and carry only a subset of the genes required for transfer. They can 'parasitise' a conjugative plasmid, transferring at high frequency only in its presence.
It is possible for plasmids of different types to coexist in a single cell. Seven different plasmids have been found in ''[[E. coli]]''. But ''related'' plasmids are often incompatible, in the sense that only one of them survives in the cell line, due to the regulation of vital plasmid functions. Therefore, plasmids can be assigned into ''compatibility groups''.
Another way to classify plasmids is by function. There are five main classes:
* ''Fertility-[[F-plasmid]]s'', which contain tra-genes. They are capable of [[bacterial conjugation |conjugation]].
* ''Resistance-(R)plasmids'', which contain genes that can build a resistance against [[antibiotic]]s or [[poison]]s. Historically known as R-factors, before the nature of plasmids was understood.
* ''Col-plasmids'', which contain genes that ''code for'' (determine the production of) [[colicine]]s, [[protein]]s that can kill other bacteria.
* ''Degrative plasmids'', which enable the digestion of unusual substances, e.g., [[toluene]] or [[salicylic acid]].
* ''Virulence plasmids'', which turn the bacterium into a [[pathogen]].
Plasmids can belong to more than one of these functional groups.
Plasmids that exist only as one or a few copies in each bacterium are, upon [[cell division]], in danger of being lost in one of the segregating bacteria. Such single-copy plasmids have systems which attempt to actively distribute a copy to both daughter cells.
Some plasmids include an ''addiction system'' or "postsegregational killing system (PSK)". They produce both a long-lived [[poison]] and a short-lived [[antidote]]. Daughter cells that retain a copy of the plasmid survive, while a daughter cell that fails to inherit the plasmid dies or suffers a reduced growth-rate because of the lingering poison from the parent cell.
==Applications==
Plasmids serve as important tools in genetics and biochemistry labs, where they are commonly used to multiply (make many copies of) or ''[[protein expression|express]]'' particular genes. Many plasmids are commercially available for such uses.
The gene to be replicated is inserted into copies of a plasmid which contains genes that make cells resistant to particular antibiotics. Next, the plasmids are inserted into bacteria by a process called ''[[transformation (genetics) |transformation]]''. Then, the bacteria are exposed to the particular antibiotics. Only bacteria which take up copies of the plasmid survive the antibiotic, since the plasmid makes them resistant. In particular, the protecting genes are expressed (used to make a protein) and the expressed protein breaks down the antibiotics. In this way the antibiotics act as a filter to select only the modified bacteria. Now these bacteria can be grown in large amounts, harvested and [[lyse]]d to isolate the plasmid of interest.
Another major use of plasmids is to make large amounts of proteins. In this case you grow bacteria containing a plasmid harboring the gene of interest. Just as the bacteria produces proteins to confer its antibiotic resistance, it can also be induced to produce large amounts of proteins from the inserted gene. This is a cheap and easy way of mass-producing a gene or the protein it then codes for, for example, [[insulin]] or even [[antibiotic]]s.
==Plasmid DNA extraction==
As alluded to above, plasmids are often used to purify a specific sequence, since they can easily be purified away from the rest of the genome. For their use as vectors, and for [[cloning#molecular|molecular cloning]], plasmids often need to be isolated.
There are several methods to isolate plasmid DNA from bacteria, the archaetypes of which are the '''miniprep''' and the '''maxiprep'''. The former can be used to quickly find out whether the plasmid is correct in any of several bacterial clones. The yield is a small amount of impure plasmid DNA, which is sufficient for analysis by [[restriction digest]] and for some cloning techniques.
In the latter, much larger volumes of bacterial suspension are grown from which a maxi-prep can be performed. Essentially this is a scaled-up miniprep followed by additional purification. This results in relatively large amounts (several ug) of very pure plasmid DNA.
In recent times many commercial kits have been created to perform plasmid extraction at various scales, purity and levels of automation. Commercial services can prepare plasmid DNA at quoted prices below $300/mg in milligram quantities and $15/mg in gram quantities (early 2007).
==Conformations==
Plasmid DNA may appear in one of five conformations, which (for a given size) run at different speeds in a gel during [[electrophoresis]]. The conformations are listed below in order of electrophoretic mobility (speed for a given applied voltage) from slowest to fastest:
* "Nicked Open-Circular" DNA has one strand cut.
* "Linear" DNA has free ends, either because both strands have been cut, or because the DNA was linear ''in vivo''. You can model this with an electrical extension cord that is not plugged into itself.
* "Relaxed Circular" DNA is fully intact with both strands uncut, but has been enzymatically "relaxed" (supercoils removed). You can model this by letting a twisted extension cord unwind and relax and then plugging it into itself.
* "Supercoiled [[Denaturation (biochemistry)|Denatured]]" DNA is like '''supercoiled DNA''' (see below), but has unpaired regions that make it slightly less compact; this can result from excessive alkalinity during plasmid preparation. You can model this by twisting a badly frayed extension cord and then plugging it into itself.
* "[[DNA supercoil|Supercoiled]]" (or "Covalently Closed-Circular") DNA is fully intact with both strands uncut, and with a twist built in, resulting in a compact form. You can model this by twisting an extension cord and then plugging it into itself.
The rate of migration for small linear fragments is directly proportional to the voltage applied at low voltages. At higher voltages, larger fragments migrate at continually increasing yet different rates. Therefore the resolution of a gel decreases with increased voltage.
At a specified, low voltage, the migration rate of small linear DNA fragments is a function of their length. Large linear fragments (over 20kb or so) migrate at a certain fixed rate regardless of length. This is because the molecules 'reptate', with the bulk of the molecule following the leading end through the gel matrix. [[Restriction digest]]s are frequently used to analyse purified plasmids. These enzymes specifically break the DNA at certain short sequences. The resulting linear fragments form 'bands' after [[gel electrophoresis]]. It is possible to purify certain fragments by cutting the bands out of the gel and dissolving the gel to release the DNA fragments.
==See also==
* [[Bacterial artificial chromosome]]
==External links==
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[[Image:Plasmid (numbers).svg|frame|right|'''Figure 1''': Schéma représentant une bactérie contenant des plasmides. 1 <font color=maroon>ADN chromosomique (bactérien)</font>. 2 <font color=navy>Plasmides</font>.]]
Un '''plasmide''' désigne en microbiologie ou en biologie moléculaire une [[molécule]] d'[[Acide désoxyribo-nucléique|ADN]] distincte de l'ADN chromosomique, capable de [[réplicon|réplication autonome]]. Le terme ''plasmide'' fut introduit par le biologiste moléculaire américain [[Joshua Lederberg]] en 1952<ref>J. Lederberg, 1952, Physiol. Rev. 32, 403-430</ref>.
Les plasmides sont généralement circulaires. Ils se trouvent quasi-exclusivement dans les [[bactérie]]s, à l'exception notable du plasmide 2Mu que l'on trouve hébergé par le micro-organisme eucaryote [[Saccharomyces cerevisiae]]'' (levure du boulanger).
Une cellule bactérienne peut en contenir une copie, pour les grands plasmides, ou des centaines pour des plasmides artificiels (construits par génie génétique à des fins de clonage de gènes). Les [[bactérie]]s en comportent généralement 5 à 30 copies, les [[levure]]s entre 50 et 100 exemplaires par cellule.
Plusieurs plasmides différents peuvent coexister dans une même cellule sous condition de leur compatibilité mutuelle. Certains plasmides sont capables de s'intégrer aux [[chromosome]]s; on appelle ces plasmides des [[épisome]]s.
Les plasmides participent aux transferts horizontaux de gènes entre les populations bactériennes, et donc à la dissémination des gènes conférant des avantages sélectifs (par exemple des résistances aux antibiotiques ou des facteurs de virulence). La mobilité des plasmides (par conjugaison) au sein des populations bactériennes accroît le spectre d’hôte des gènes impliqués dans la virulence. Ces gènes offrent en contrepartie un avantage sélectif pour le plasmide et les bactéries hôtes. On conçoit donc la nature quasi-ubiquitaire et persistante des plasmides chez les bactéries pathogènes.
==Réplication et transmission==
Chaque plasmide contient au moins une séquence d'ADN qui sert d'[[origine de réplication]], ou ''ori'' (un point de départ de [[réplication de l'ADN]]), permettant à l'ADN plasmidique d'être dupliqué indépendamment du chromosome bactérien ou saccharomycien (Figure 2), en utilisant la « machinerie » de la cellule hôte. Les plasmides peuvent être circulaires, ou parfois linéaires, présentant une ressemblance superficielle avec les chromosomes eucaryotes.
Comme les plasmides présents chez les bactéries ne portent habituellement pas de [[gène]]s essentiels à la cellule [[procaryote]], leur pérennité dans une lignée de [[bactérie]]s dépend donc de divers moyens de [[stabilisation des plasmides]], laquelle résulte de divers processus de sélection et de conditions environnementales.De plus, les plasmides peuvent servir de synthétiseur pour les bactéries.
Les plasmides peuvent se transmettre d'une bactérie mère à une bactérie fille grâce à la [[Conjugaison (génétique)|conjugaison bactérienne]] par l'intermédiaire de [[pilus|pili]] sexuels.
Lors de la division cellulaire, les plasmides se répartissent de façon totalement aléatoire (contrairement aux chromosomes) ainsi, même si la probabilité reste faible, il se peut qu'une des deux cellules filles ne possède aucun plasmide. La probabilité augmente avec la diminution du nombre de plasmides présents dans la cellule mère.
{{Voir aussi|Stabilisation des plasmides}}
==Épisomes==
[[image:plasmid_episome.png|right|frame|'''Figure 3''': Comparaison de plasmides non-intégrants (''en haut'') et d'épisomes (''en bas''). 1 <font color="#009900">ADN chromosomique</font>. 2 <font color="#990000">Plasmides</font>. 3 <font color="#000099">Division cellulaire</font>. 4 <font color="#009900">ADN chromosomique</font> avec <font color="#990000">plasmides intégrés</font>.]]
Un '''épisome''' est un plasmide qui peut s'intégrer dans l'ADN chromosomique de la cellule-hôte (Fig. 3). De ce fait, il peut rester intact pendant de longues périodes, être dupliqué à chaque [[division cellulaire]] de l'hôte, et devenir partie intégrante de son patrimoine génétique. Le terme n'est plus en usage pour les plasmides, depuis qu'il a été établi qu'une région d'homologie avec le chromosome, comme un [[transposon]], fait d'un plasmide un épisome. Dans les systèmes mammifères, le terme ''épisome'' fait référence à un ADN circulaire (comme un génome viral) attaché au chromosome de la cellule-hôte de façon non-covalente.
==Vecteurs==
<!--Plasmids used in genetic engineering are called [[vector (biology)|vectors]]. They are used to transfer genes from one organism to another and typically contain a [[genetic marker]] conferring a [[phenotype]] that can be selected for or against. Most also contain a [[polylinker]] or [[multiple cloning site]] (MCS), which is a short region containing several commonly used [[restriction sites]] allowing the easy insertion of DNA fragments at this location. See [[#Applications|Applications]] below.
-->Existant à l'état naturel, les plasmides sont par ailleurs très utilisés dans les laboratoires comme ''vecteur de [[clonage]]''. Cette technologie est couramment utilisée en biologie moléculaire.
==Propriétés codées par les plasmides==
===Les plasmides conjugatifs===
{{Article détaillé|Conjugaison (génétique)}}
Les plasmides conjugatifs sont les premiers plasmides qui ont été découverts chez la bactérie ''[[Escherichia coli]]'' dans les [[années 1950]]. On les appelle aussi facteurs de fertilité ou plasmides '''F'''. Ces plasmides confèrent à la bactérie hôte la capacité de synthèse de [[pilus|pili]] dit sexuels. Par l'intermédiaire de ces pili, la bactérie porteuse (donneuse) peut transférer une copie du plasmide '''F''' par processus de conjugaison bactérienne. Les plasmides '''F''' possèdent au minimum une origine de réplication et tous les gènes nécessaires à la synthèse des pili et du transfert du plasmide. Certains plasmides '''F''' sont des épisomes, c'est-à-dire qu'ils peuvent s'intégrer dans le [[génome]] chromosomique.
===Les plasmides de résistance===
[[image:example_plasmid.png|left|thumb|'''Figure 2''': Schéma d'un plasmide codant la résistance à un antibiotique donné. <font color='#009900'>1</font> & <font color='#000099'>2</font> Gène(s) codant la (les) résistance(s). <font color='#990000'>3</font> Ori.]]
Les plasmides de résistance, appelés aussi plasmides ou facteurs '''R''', codent des [[résistance aux antibiotiques|résistances aux antibiotiques]] et aux [[métal lourd|métaux lourds]].
En [[1959]], au [[Japon]], on a retrouvé chez les malades atteints de [[dysenterie bactérienne]] une insensibilité à tout traitement [[antibiotique]]. En fait, la bactérie responsable, ''[[Shigella dysentariae]]'', portait des gènes de résistance à plusieurs antibiotiques encore jamais rencontrés. Par la suite, on en a retrouvé chez d'autres bactéries (comme ''E. coli'') et on a appelé ces plasmides '''R'''.
Ces plasmides peuvent ''protéger'' la cellule par différents moyens : La synthèse d'une protéine de résistance à la substance toxique : elle va neutraliser (en la dénaturant, hydrolysant, etc.) l'activité [[toxique]] de la substance. Les plasmides peuvent aussi modifier les propriétés d'enveloppe de la cellule et la rendre [[imperméable]] à la substance toxique (comme c'est le cas pour les métaux lourds).
{{clr}}
===Les plasmides métaboliques===
Les plasmides métaboliques portent des gènes permettant l'utilisation de certains [[nutriment]]s. Chez ''E. coli'', les gènes portés par ces plasmides sont par exemple : l'utilisation du [[citrate]] comme source de [[carbone]], la production de [[soufre]], l'hydrolyse de l'[[urée]]. Chez les [[salmonelle]]s on a observé la dégradation du [[lactose]] ce qui est totalement inhabituel chez ce genre bactérien. La plupart de ces plasmides codent la synthèse d'une ou de plusieurs enzymes.
===Les plasmides de virulence===
Il s’avère que les bactéries pathogènes hébergent très souvent des plasmides conjugatifs qui participent à la pathogénicité. Les plasmides de virulence portent des gènes codant des facteurs de virulence, ayant un rôle dans le pouvoir [[pathogène]] des bactéries. Par exemple les ''Escherichia coli'' entérotoxigéniques (ETEC) responsable de la [[diarrhée du voyageur]] (ou ''tourista'') hébergent au moins deux plasmides, l'un portant les gènes codant un facteur de colonisation, l'autre codant des toxines.
De même, les déterminants du pouvoir invasif des ''[[Shigella]]'' sont portés par un plasmide (pInv). Chez d'autres bactéries pathogènes (par exemple ''[[Salmonella]]''), ces plasmides codent un complexe protéique situé sur la paroi de la bactérie : c'est le complexe ''pili-adhésine'' qui permet à la bactérie d'adhérer sur des récepteurs hydrocarbonés situés à la surface de certaines cellules eucaryotes notamment les [[entérocyte]]s. Certains plasmides codent pour des facteurs tumorigènes; c'est notamment les cas pour la "galle des végétaux" dû à un plasmide T.
===Les plasmides de bactériocines===
Ces plasmides codent la synthèse d'une protéine extracellulaire dont la biosynthèse est létale pour la bactérie productrice ainsi que pour les autres bactéries non-productrices environnantes. Cependant, ces plasmides codent aussi une deuxième protéine intracellulaire de résistance à cette première toxine. Les [[bactériocine]]s agissent sur des fonctions vitales de la bactérie.
Chez ''E. coli'', on trouvera différentes catégories de bactériocines (colicines codées par les plasmides ''col'') et par exemple le gène '''colE1''' code une [[endonucléase]] et le gène '''colE3''', une [[ribonucléase]] qui inactive les [[ribosome]]s.
{{Article détaillé|Structure et fonctionnement d'un opéron poison-antidote}}
==Fabrication de plasmides recombinants==
À compléter
==Application en génie génétique==
===Application pour la production de molécule===
On désire faire produire par des bactéries une certaine [[protéine]] (protéine d'intérêt). C'est par l'intermédiaire de plasmides qu'on introduira dans des cultures de [[bactérie]]s un gène codant notre protéine d'intérêt et un gène de résistance à un [[antibiotique]] X. On sélectionnera les bactéries ayant intégré les plasmides en faisant pousser les colonies bactériennes sur un milieu contenant l'antibiotique X; les bactéries n'ayant pas intégré le plasmide ne se développeront pas.
===Application pour le séquençage===
Cette application est particulièrement utile en [[génie génétique]] pour le [[séquençage]] d'ADN : l'[[Acide désoxyribonucléique|ADN]] d'une cellule quelconque est difficile à séquencer car il dépasse très souvent 40 000 Kb (1 Kilo base = 1 000 bases) et se trouve en faible quantité. Ainsi, pour rendre le séquençage plus facile, on découpe l'ADN à analyser et l'ADN plasmidique avec une [[enzyme de restriction]], dans des conditions spécifiques; l'ADN à séquencer va s'intégrer dans l'ADN plasmidique et le plasmide sera transféré dans le [[hyaloplasme]] bactérien. Une fois mise en culture, la bactérie va répliquer l'ADN plasmidique (et donc le fragment à séquencer) en grande quantité. Après avoir extrait l'ADN à séquencer, et éliminé le reste d'ADN plasmidique par des enzymes de restriction, on récupère les fragments d'ADN reproduits à plusieurs milliers d'exemplaires, que l'on peut maintenant séquencer ''facilement''.
==Références==
<references />
== Liens externes ==
*[http://www.maxanim.com/genetics/Plasmid/Plasmid.htm Integration and Excision of a Plasmid] Flash Animation
*[http://www.ispb.org/ International Society for Plasmid Biology and other Mobile Genetic Elements]
*[http://histmicro.yale.edu/mainfram.htm History of Plasmids with timeline]
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