Séquençage des protéines
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2008-07-05T10:06:28Z
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ajout d'images sur methode de sanger et chlorure de dansyle
Le '''séquençage des protéines''' est la détermination de la séquence polypeptidique. Elle est destinée à connaître le nombre, la nature chimique et l'ordre de tous les résidus d'[[acide aminé|acides aminés]] dans un [[polypeptide]]. Pour cela, si la [[protéine]] contient plus d'une chaîne polypeptidique, les chaînes doivent être d'abord séparées, puis purifiées. Généralement, toutes les [[pont disulfure|liaisons disulfures]] seront réduites et les [[thiol]]s ainsi obtenus alkylés. Après isolement d'une chaîne polypeptidique, la séquence peut être étudiée:
* en faisant appel à des méthodes récurrentes chimiques ou enzymatiques libérant les [[acides aminés]] un à un à partir de l'extrémité C ou N terminale;
* ou plus récemment par des méthodes de [[spectrométrie de masse]] ([[séquençage]] à nouveau).
Le séquencage des protéines est plus difficile que celui de l'[[ADN]].
==Historique==
C'est dans les années 50 que [[Frederick Sanger]] et les chercheurs de l'Université de Cambridge ont déterminé la séquence des acides aminés qui composent l'[[insuline]]. Pour cela, plutôt que d'hydrolyser complètement l'hormone, ils ont utilisé des [[enzyme]]s catalysant la coupure des [[polypeptide]]s au niveau de sites spécifiques. Les fragments résultants ont été séparés par [[chromatographie]], puis partiellement hydrolysés pour donner un nouveau groupe de fragments. À ce stade, Sanger utilisa des méthodes chimiques pour déterminer la séquence des acides aminés. À partir des séquences obtenues il rechercha des chevauchements afin de reproduire la séquence initiale. Il fallut plusieurs années à Sanger pour reconstituer la structure primaire de l'insuline. Depuis, la plupart des étapes du séquençage des protéines ont été automatisées. Actuellement le séquençage des protéines a été largement délaissé au profit de celui des [[acides nucléiques]] (ADN principalement et ARN), plus rapide et plus performant.
== Les structures ==
{{Article détaillé|Structure des protéines}}
Chaque protéine est une [[macromolécule]] constituée par l'enchaînement de molécules de masse moléculaire plus petite appelées [[monomère]]s : les [[acides aminés]].
===La structure primaire===
{{Article détaillé|Structure primaire}}
Les acides aminés (''AA'') s'assemblent grâce à des liaisons peptidiques (groupement cétone d'un AA avec le groupement amine d'un AA voisin → {{fchim|C=O—NH|2}}), et forment ainsi la '''structure primaire'''.
===La structure secondaire===
{{Article détaillé|Structure secondaire}}
La '''structure secondaire''' peut se manifester sous deux formes:
* Élément A : L'hélice <math>\alpha</math> (en spirale – exemple : la [[kératine]]). Ce sont les [[protéine fibreuse|protéines fibreuses]].
* Élément B : Le feuillet plissé <math>\beta</math> (en escalier – exemple : l'[[hémoglobine]]). Ce sont les [[protéine globulaire|protéines globulaires]].
Cette structure est due à l'existence de [[Liaison hydrogène|liaisons hydrogène]] qui se forment entre des liaisons peptidiques voisines.
===La structure tertiaire===
Soit le feuillet plissé <math>\beta</math>, soit l'hélice <math>\alpha</math> s'assemblent en '''structure tertiaire'''<ref>[http://sti-bio.scola.ac-paris.fr/PEDAGO/proteines/html/myoglobine.html Exemple : étude de la myoglobine]</ref> par des [[liaisons secondaires]] qui se créent entre les radicaux des acides aminés qui, lors de la formation de la structure secondaire, se sont retrouvés à l'extérieur de la structure (exemples : [[liaison saline]], [[liaison hydrogène|hydrogène]], [[pont disulfure]]). Ces liaisons, hormis le pont disulfure qui est une liaison [[covalente]] forte, sont des liaisons covalentes faibles.
Ce repliement de la chaîne peptidique amène la création d'un [[site actif]] responsable de l'activité biologique de la protéine.
===La structure quaternaire===
Certaines protéines, dites [[oligomère|oligomériques]] (constituées par plusieurs chaînes de polypeptides – chaque chaîne présente une structure primaire, secondaire et tertiaire), telle que l'[[hémoglobine]] par exemple, atteignent une '''structure quaternaire''' en adoptant une construction symétrique et paire par l'association de ces différents [[protomère]]s. Ces protéines ne voient la création de leur [[site actif]] que lorsque cette structure a été atteinte.
== La dénaturation ==
{{Article détaillé|Dénaturation}}
La '''dénaturation''' est une désorganisation de la structure spatiale sans rupture des [[Liaison peptidique|liaisons peptidiques]], car seules les [[liaisons secondaires]] sont concernées.
=== Conséquences de la dénaturation ===
*Perte de l'activité biologique
*Changement des propriétés optiques
*Perte de la [[solubilité]] car précipitation
===Les agents dénaturants===
Ils sont nombreux et peuvent être physiques ou chimiques.
====Les agents dénaturants physiques====
* [[Température]] : Toute augmentation de la température provoque une rupture des [[liaisons hydrogène]].
* Modification de [[Potentiel hydrogène|pH]] : Elle entraîne une modification des charges portées par les groupements ionisés, d'où une rupture de ces liaisons.
* Violets et ultraviolets : Dénaturation totale.
====Les agents dénaturants chimiques====
*L'[[urée]] et le [[SDS]] ([[détergent]]) : Hydrolysent les [[liaisons hydrogène]].
*Le <math>\beta</math> mercaptoéthanol et l'acide performique : Rupture des [[Pont disulfure|ponts disulfures]].
*Les [[Base (chimie)|bases]] et [[détergent]]s provoquent une forte dénaturation protéique.
*Les défécants : Précipitation des protéines ([[défécation]])
*Le bromure de cyanogène (BrCN) : clive la [[méthionine]].
===Importance de la dénaturation===
[[In vitro]] : pour les extractions d'[[enzyme]]s, on évite les dénaturations. Mais pour une [[stérilisation (microbiologie)|stérilisation]], on les provoque.
C'est également en faisant agir des dénaturants sur des protéines que l'on va pouvoir les séquencer.
==Détermination de la composition d'une protéine en acides aminés==
===Rupture des ponts disulfure===
La rupture des [[pont disulfure|ponts disulfure]] entre les [[cystéine]]s est avant tout une dénaturation chimique, qui est de plus essentielle pour pouvoir séparer les différents groupes d'acides aminés. On utilise à cet effet des agents réducteurs porteurs de fonctions [[thiol]] (–SH), comme le 2-mercaptoéthanol ou le dithiothreitol (réactif de Cleland). Il existe également des réducteurs non-thiolés comme le TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine).
Il faut savoir également que deux cystéines sont réunies par leur groupement [[thiol]] (–SH), et forment alors une molécule appelée [[cystine]].
La cystéine est un acide aminé, elle peut donc être dénaturée. Le pont disulfure est responsable de la structure tertiaire des protéines, apportant une grande stabilité a cette dernière.
===Hydrolyse des liaisons peptidiques===
L'[[hydrolyse]] des [[liaison peptidique|liaisons peptidiques]] permet de séparer les différents [[acides aminés]], car elles sont responsables de la structure primaire, agissant entre le groupement [[cétone]] d'un acide aminé (C=O) et le groupement [[amine (chimie)|amine]] (NH2) d'un AA (acide aminé) voisin.
*Hydrolyse totale acide :
**Utilisation d'[[acide chlorhydrique]] (HCl) à 6 mol/L à chaud (110°C) et pendant 24h environ.
**L'hydrolyse acide totale détruit le [[tryptophane]] et transforme en acide les fonctions amides de la [[glutamine]] et de l'[[asparagine]] pour donner du [[glutamate]] et de l'[[aspartate]].
*Hydrolyse totale alcaline:
**Utilisation d'[[hydroxyde de sodium]] (NaOH) à 4 mol/L à chaud (110°C) pendant 24h environ.
**L'hydrolyse totale alcaline détruit la [[sérine]], la [[thréonine]], la [[cystéine]].
L'hydrolyse totale acide détruisant moins d'acides aminés, elle est en conséquence la méthode d'hydrolyse la plus utilisée.
===Analyse de l'hydrolysat===
Après rupture des liaisons disulfures au 2-mercaptoéthanol et une hydrolyse, l'hydrolysat est déposé sur une résine échangeuse d'anions ou de cations. Une fois les fractions récupérées on les colore à la [[ninhydrine]] et on mesure l'[[absorbance]] à 570nm. On obtient finalement une estimation du pourcentage de chaque acide aminé contenu dans la chaîne (% de résidus [[alanine]],...). La détermination de cette composition n’est pas nécessaire pour déterminer la séquence et est de fait de moins en moins pratiquée.
==Détermination de la séquence==
===Le marquage chimique de l'extrémité N-terminale (NH<sub>2</sub>)===
* La première méthode utilise la réaction de Sanger (cf. [[Acide aminé#Arylation|arylation]]). Les fonctions 2-amine des [[acides aminés]] et [[peptide]]s réagissent avec le 2,4-dinitrofluorobenzène pour former des dérivés jaunes, les 2,4-dinitrophényl-peptides. Lorsque ces derniers composés sont soumis à une hydrolyse acide, toutes les [[liaison peptidique|liaisons peptidiques]] sont hydrolysées, mais la liaison entre la fonction 2,4-dinitrophényl et la fonction amine de l'[[acide aminé]] N-terminal restent stables, d'où l'identification de ce dernier.
[[Image:Methode Sanger.png ]]
* La deuxième méthode utilise le [[chlorure de dansyle]], qui, combiné à une hydrolyse totale acide forme un Dansyl-AcideAminé1 (DNS-aa) qui est fluorescent et un hydrolysat.
[[Image:Chlorure Dansyle.PNG]]
* Une troisième méthode est celle d'Edman, dans laquelle le phénylisothiocyanate (PITC) réagit avec la fonction amine N-terminale pour donner un complexe qui, après action d'un acide dans des conditions douces libère une phénylthiohydantoïne et le [[peptide]] restant intact (cf. [[Acide aminé#Carbamylation|carbamylation]]). Les deux premières méthodes utilisant une hydrolyse totale acide, le reste de la chaîne peptidique voit ses acides aminés clivés. Le grand avantage de la méthode d'Edman est que la chaîne peptidique reste intacte et peut être récupérée et soumise à nouveau au traitement avec le PITC. En itérant le processus, on peut ainsi lire successivement les acides aminés de la protéine, à partir de leur extrémité N-terminale.
=== Identification des acides aminés C-terminaux===
On utilise l'hydrazynolise, qui coupe les liaisons à 100°C et donne un [[acide aminé]] libre. On peut également utiliser des [[carboxypeptidase]]s qui coupent l'extrémité C-terminale, il en existe plusieurs types:
*la carboxypeptidase A, qui coupe tout sauf les acides aminés basiques (elle est bloquée par la [[proline]])
*la carboxypeptidase B, qui est spécifique des acides aminés basiques (Lys, Arg)
=== Analyse enzymatique des extrémités N et C-terminales ===
Il existe également des méthodes biochimiques utilisant des [[enzyme]]s capable de couper le premier ou le dernier acide aminé de la chaîne polypeptidique, on les appelle des [[exopeptidases]]. Les [[aminopeptidase]]s clivent la liaison peptidique située juste après le premier acide aminé et libèrent celui-ci. De manière symétrique, les [[carboxypeptidase]]s clivent la liaison peptidique située juste avant le dernier acide aminé.
Il en existe plusieurs de ces enzymes de spécificités variées, par exemple parmi les carboxypeptidases, on trouve :
* La carboxypeptidase A, clive l'acide aminé C-terminal lorsque celui-ci est [[Hydrocarbure aromatique|aromatique]] ou [[aliphatique]]
* La carboxypeptidase B, clive l'acide aminé C-terminal lorsque celui-ci est [[basique]] ([[Arginine]] ou [[Lysine]])
* La carboxypeptidase Y à spectre large
En analysant les acides aminés libérés par ces enzymes, il est possible d'analyser la séquence N ou C-terminale de la protéine.
=== Fragmentation de la chaîne polypeptidique===
La chaîne polypeptidique est découpée en une série de petits [[peptide]]s par des hydrolyses enzymatiques ou chimiques.
==== Méthode chimique ====
L'hydrolyse chimique la plus utilisée implique une réaction avec le bromure de cyanogène, qui scinde les [[liaison peptidique|liaisons peptidiques]] dans lesquelles la fonction [[carboxyle]] est fournie par des résidus de [[méthionine]].
==== Méthode enzymatique (utilisation d'endopeptidases) ====
L'hydrolyse enzymatique utilise les [[protéase]]s, [[enzyme]]s qui hydrolysent les [[liaison peptidique|liaisons peptidiques]]. La [[trypsine]] catalyse l'hydrolyse des liaisons peptidiques dans lesquelles la fonction carboxyle est fournie par la [[lysine]] ou l'[[arginine]], la chymotrypsine permet la coupure du côté C-terminal des [[acides aminés]] aromatiques ([[Phénylalanine|Phe]], [[Tryptophane|Trp]] et [[Tyrosine|Tyr]]).
* [[Trypsine]] (C) : <small>[[Lysine|LYS]]</small>, <small>[[Arginine|ARG]]</small> (sauf si <small>[[Proline|PRO]]</small> à droite)
* [[Chymotrypsine]] (C) : <small>[[Phénylalanine|PHE]]</small>, <small>[[Tryptophane|TRP]]</small>, <small>[[Tyrosine|TYR]]</small> (sauf si <small>PRO</small> à droite)
* [[Thermolysine]] (N) : <small>[[leucine|LEU]]</small>, <small>[[Isoleucine|ILE]]</small>, <small>[[valine|VAL]]</small> (sauf si <small>PRO</small> à gauche)
* [[Pepsine]] (N) : <small>[[Phénylalanine|PHE]]</small>, <small>TRP</small>, <small>[[Tyrosine|TYR]]</small> (sauf si <small>PRO</small> à gauche)
* LysC
* Papaïne : très utilisée dans l’industrie agro-alimentaire et chimique, elle permet notamment en boucherie d’attendrir la viande. Elle est aussi utilisée dans les produits de nettoyages de verres de contact, ainsi que dans les poudres à lessive, où son action est de détruire les protéines responsables des taches.
* Clostripaïne
* Subtilisine
* Elastase
* etc.
=== Identification de la séquence ===
L'identification de la séquence se fait de manière logique à partir des résultats obtenus par l'utilisation des différentes méthodes décrites précédemment.
== Notes et références ==
*Cours de première année de Biochimie
== Références ==
<references />
{{Portail Biochimie}}
[[Catégorie:Méthode de la biochimie]]
[[Catégorie:Protéomique]]